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水稻不育系系谱抗稻瘟病基因同源序列的克隆与

发布时间:2019-12-01 01:38编辑:admin浏览(172)

      亚热带农业研究 Subtropical Agriculture Research 第6卷第3期 2010年8月 水稻不育系系谱抗稻瘟病基因同源 序列的克隆与序列剖析 黄姗 ,林晶 ,吴志源 ,黄利兴 ,游年顺 ,梁康迳 (1.福建农林大年夜学作物遗传育种与综合应用教导部重点试验室,福建福州350002; 2.福建省农业迷信院水稻研究所,福建福州365509) 摘要:依据已知NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的守旧区域设计简并引物,对水稻不育系系谱NBS.LRR类抗病基因同 源序列停止克隆、测序和聚类。同源序列克隆与剖析标明,7个水稻不育系系谱亲本中共取得14个阳性克隆,个中11个含 有NBS—LRR类抗病基因所独有的守旧氨基酸结构域Kinase I、KinaseⅡ、KinaseII及跨膜区域。这些片段间同源性最高达 98.3%,最低仅为29.7%;11个氨基酸片段与抗病基因Xa/(AB002266)的同源性较高,42%一45%的氨基酸序列相反, 59%一64%的氨基酸序列相似,且与水稻其他NBS—LRR类抗性蛋白相似性很高。经过聚类剖析,可以将其分为3类,辨别 记为Gl、G2、G3,并发明抗源谷农l3所含有的G3类基因,经过天谷、福伊传给后代谷丰、全丰。 关键词:水稻;不育系系谱;抗稻瘟病;NBS—LRR类同源克隆 中图分类号:Q943.2 文献标识码:A 文章编号:1673-0925(2010)03-0199-O6 Cloning and sequences analyzing of resistance genes from rice blast sterile line lineage HUANG Shan ,LIN Jing ,WU Zhi—yuan ,HUANG Li—xing ,YOU Nian.shun ,LIANG Kang-jing (1.Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding and Comprehensive Utilization,Ministry of Education, Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China;2.Rice Research Institute, Fujian Academy of Agricuhural Sciences,Fuzhou,Fujian 365509,China) Abstract:According to the known conserved domain of the amino acid in the NBS—LRR structure genes,we could design the degen. erate primer and clone,sequence and cluster the resistance gene analogs(RGAs)by PCR in order to study the passing rules of re. sistanee genes and analyze the comparability of blast phenotype and RGAs,offering the scientific reference for utility and clone of rice blast genes.The cloning and analysis of the homologous sequence of resistant genes of the rice sterial line lineage showed that 14 masculine clones had been obtained from 7 rice sterial line lineage.And there were only 1 1 NBS—LRR resistant genes which had particular conservative domain,Kinase I,Kinase lI,KinaseⅢand transmembrance domain.In tlle amino acid segments of the NBS·LRR type,the maximal homologous quality was 98.3%,the minimum Was 29.7%.These 1 1 NBS—LRR type sequences were highly homologic to resistant gene Xal(AB002266),which had 42%一45%identical amino acids and 59%一64%similar amino acids by the BLAST in NCBI.These NBS·LRR type resistant sequences had been separated into three types,which were named G1, G2.G3 by clustering analysis.And it showed that the G3 type genes of Gunongl3 had been passed to generation of Gufeng and Quangfeng through the generation Tiangu and Fuyi. Key words:rice;sterial line lineage;blast resistance;NBS—LRR type homologous clone 近十几年来在多栽种物中已克隆到一系列的抗病基因_1 。同类型的抗病基因存在合营的守旧区 域,依据这些守旧结构的序列设计简并引物,并应用PCR技巧扩增和分别具有相似序列的DNA片段,即 抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGAs),称为同源克隆。因为同源克隆方法复杂,不需求取得 收稿Et期:2010—08—04 基金项目:福建省天然迷信基(2008J0050),福建省省属公益性项目(2009R10026-2),福建省严重专项(2008NZ0001)资助项目。 作者简介:黄姗(1985一),女,硕士研究生。研究标的目标:水稻遗传育种。Email:hill2006hiU@yahoo.com.all。通信作者粱康迳(1954一),男, 研究员,博士生导师。研究标的目标:水稻遗传育种。Email:lianski_2005@126.tom。 ·200· 亚热带农业研究 第6卷 转座子突变体或构建复杂的分子标记连锁图,因此这类克隆抗病基因的新思路倍受喜爱。任鄄胜等 利 用25个稻瘟病辨别种类(系)和2O个水稻种类(系)在人工接种条件下对立病基因同源序列多态性停止 聚类比拟剖析,认为对亲本资料停止单孢菌株抗性判定和抗病基因同源序列多态性剖析,能更准确地反应 亲本抗性遗传配景,从而防止统一抗源重复应用。周玮斌等 应用NBS守旧区设计引物,从通俗野生稻 基因组中克隆了4个分歧的NBS同源序列(OSNBA1一OSNBA4)。刘继梅等l1叫依据已报导的NBS LRR 类和STK类抗病基因结构中的氨基酸守旧区域设计简并引物,经过PCR扩增及克隆,从通俗野生稻、药用 野生稻、疣粒野生稻中共取得14类NBS-LRR类抗病基因同源序列。应用NBS—LRR类守旧氨基酸序列设 计引物,经过RGA同源克隆的方法取得水稻不育系系谱亲本的抗稻瘟病片段,关于深人评论辩论水稻不育系 系谱的抗稻瘟病基因传递规律,进而取得抗稻瘟病基因的全序列具有指导意义。有关该方面的研究还没有 见报导。因此,本研究以福建省农科院水稻研究所育成的一个水稻不育系抗稻瘟病系谱¨ 为研究资料, 对该系谱亲本停止抗病基因同源序列的克隆与剖析,评论辩论水稻不育系系谱抗病基因的遗传规律,以期为进 一步克隆抗稻瘟病基因的全序列供给依据。 1资料与方法 1.1试验资料 7个水稻不育系抗稻瘟病系谱亲本:谷农13、天谷、福伊、谷丰、全丰、V41B、龙特甫B,供试资料由福 建省农科院水稻研究所供给。大年夜肠杆菌(Escherichia coli)DH5ct由福建农林大年夜师长教师态学试验室供给, pMD18一T Vector购自TaKaRa公司。 1.2试验方法 1.2.1 DNA的提取7个亲本培养至4叶期时(约30 d摆布)采样,采取改良的CTAB法¨ 提取DNA。 1.2.2引物设计参照文献[13],依据NBS-LRR类R基因的守旧氨基酸序列,应用软件Primer 5.0设计 4种简并特异引物(表1)。 表1 NBS.LRR类抗病基因简并引物 Table 1 Degenerate primer of NBS·-LRR type blast·-resistance genes ”混淆碱基代码:R=A/G,w=A/T,S:C/G,H=A/T/C,N=A/T/G/C,Y=c/r,M:A/C,个中I为次黄嘌呤。 1.2.3 RGA-PCR扩增采取25 的PCR反应系统。PCR反应条件为:94℃预变性3 min;94℃变性 30 s,46℃复性60 s,72 clC延长2 min,共停止35轮回;72℃延长7 min。取7 L PCR扩增反应液停止 1.O%琼脂糖凝胶电泳分别。 1.2.4 目标片段的克隆-9测序 采取pMD18.T为载体连接目标片段,并将其转化到大年夜肠肝菌 coli DH5ct的感触感染态细胞,SDS碱裂解法制备质粒DNA,并用EcoR I和 t I停止双酶切判定。将判定后的重 组阳性克隆菌提交上海Sangon生物技巧效劳公司停止测序。 1.3序列的统计与剖析 应用GenBank中的Blast剖析依次(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜刮数据库停止序列的同源性比 较剖析,应用DNAssist停止序列守旧区域的比拟剖析。同时对同源序列应用DNAstar(Clustal W方法)和 DNAssist软件停止聚类剖析。 第3期 黄姗等:水稻不育系系谱抗稻瘟病基因同源序列的克隆与序列剖析 ·20l· 2结果与剖析 2.1同源目标片段的PCR扩增 应用引物组合PR2和ER4停止PCR扩增和克隆,7 个水稻种类均取得了了单一的DNA条带,扩增产品的长 度约490—500 bp(图1)。将扩增产品收受接管、连接、转化 后初步遴选掉掉落阳性克隆l4个。 2.2抗病基因同源片段的序列剖析 7个水稻种类的14个克隆定名见表2。l4个阳性 克隆中有3个没法推导出完整的氨基酸序列,即天谷的 C2-6、谷丰的C5-4、全丰的C104,其他均具有NBS—LRR 类抗病基因所独有的守旧氨基酸结构域(图2,如Kinase I、Kinase II和Kinase111)及跨膜区域等,因此共取得11 个NBS.LRR类抗病基因的同源片段。个中水稻不育系 谷农l3、福伊、V41B、龙特甫B各取得2个同源片段,天 谷、谷丰、全丰各取得1个同源片段。 2.3抗病基因同源片段的氨基酸序列聚类剖析 对水稻抗病不育系种类及其亲本的l1个NBS.LRR 类抗病基因的氨基酸序列,采取软件DNAstar,应用 Clustal W方法停止聚类剖析(图3),在核酸的交换值为 0.2处,将l1个NBS.LRR类抗病基因同源序列分为3 类。个中C14-2为第l类,记为I;C2-2、C3-6为第2类, 记为II;其他的为第3类,记为Ⅲ。用DNAsis软件对这 M.Mark,1.阴性对比,2—8辨别为水稻亲本谷农l3、 天谷、福伊、安丰、全丰、V41 和龙特甫B。 图1 NBS-LRR类同源序列PeR产品电泳图 Fig.1 Electrophoresis ofPCR product ofNBS—LRR type homologous sequences 表2分歧水稻品

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